藥物中基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)分析方法的相關(guān)探究！
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基因毒性雜質(zhì)具有極大的危害性，為保障用藥安全，必須嚴(yán)格把控其在藥物中的含量限度。這類雜質(zhì)存在種類繁多、化學(xué)性質(zhì)活潑等特點(diǎn)，導(dǎo)致分析檢測(cè)方法復(fù)雜多樣，這對(duì)藥物中基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法的制定提出了頗高要求。下面小編從基因毒性雜質(zhì)的研究思路、來(lái)源、分類、限度、檢測(cè)方法及研究難點(diǎn)六個(gè)維度展開(kāi)總結(jié)與分析，旨在為藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)工作提供有益參考。?
在藥品中，那些影響其純度的物質(zhì)被稱作雜質(zhì)。藥品里的雜質(zhì)通常沒(méi)有治療功效，部分還會(huì)對(duì)藥物的穩(wěn)定性和療效產(chǎn)生不良影響，甚至可能引發(fā)不良用藥事件。?
藥物中雜質(zhì)的來(lái)源主要有兩個(gè)方面：一是在藥物生產(chǎn)過(guò)程中引入;二是在儲(chǔ)藏或運(yùn)輸過(guò)程中，因受到外界條件影響，藥物的理化特性發(fā)生改變而產(chǎn)生。Ashby 等人在對(duì) 300 多種化合物對(duì) DNA 活性影響的研究基礎(chǔ)上，首次提出了基因毒性的概念。?
基因毒性雜質(zhì)(genotoxic impurity，GTI)指的是 “經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)倪z傳毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，如?xì)菌基因突變(Ames)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)具有遺傳毒性的雜質(zhì)”。該類雜質(zhì)可能通過(guò)基因突變、染色體畸變、DNA 損傷與修復(fù)等途徑，與 DNA 發(fā)生直接或間接的相互作用，進(jìn)而改變 DNA 的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象、造成 DNA 損傷，影響 DNA 功能或改變其遺傳特性，最終可能引發(fā)突變、癌變、畸變等遺傳毒性。?
有關(guān)藥物中基因毒性雜質(zhì)超標(biāo)導(dǎo)致藥品召回的事件屢有報(bào)道，各國(guó)藥品監(jiān)督管理部門紛紛出臺(tái)一系列關(guān)于藥物中基因毒性雜質(zhì)控制的指導(dǎo)文件，目的就是嚴(yán)格控制該類雜質(zhì)在藥物中的限度。本文從基因毒性雜質(zhì)的研究思路、來(lái)源、分類、限度、檢測(cè)方法和研究難點(diǎn)六個(gè)方面進(jìn)行剖析與總結(jié)，為該類雜質(zhì)的研究提供一定的理論依據(jù)和參考。?
1、基因毒性雜質(zhì)的研究思路?
要將藥物中的基因毒性雜質(zhì)完全去除，在實(shí)際操作中難度極大。ICH、EMA 和 FDA 都頒布了相關(guān)的基因毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)文件，推薦采用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC，1.5 μg?d?1)來(lái)控制用藥風(fēng)險(xiǎn)。?
TTC 的具體含義是，在人的一生中(以 70 歲計(jì))，每天攝入 1.5 μg 基因毒性雜質(zhì)，其致癌風(fēng)險(xiǎn)處于可接受范圍(<1/100000)。所以在實(shí)際檢測(cè)中，基因毒性雜質(zhì)采用限度檢查的方法。藥物中基因毒性雜質(zhì)的具體研究思路如下：?
① 根據(jù)藥物合成工藝中使用的起始物料、試劑和催化劑等，結(jié)合可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，推測(cè)藥物中可能引入的基因毒性雜質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行分類。?
② 確定雜質(zhì)可接受的最大限度。?
③ 開(kāi)發(fā)藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法。?
④ 建立專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析速度快的分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。?
⑤ 對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)定，確認(rèn)樣品中基因毒性雜質(zhì)的限度是否符合要求。?
根據(jù)研究思路、待測(cè)物的性質(zhì)以及各種檢測(cè)手段的特點(diǎn)，可總結(jié)出基因毒性雜質(zhì)的研究決策樹(shù)。?
2、基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源?
藥物中基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源包括原料藥合成的起始物料、反應(yīng)中間體、催化劑和試劑等。此外，在藥物的合成、制劑生產(chǎn)、儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中也可能生成基因毒性雜質(zhì)。由此可見(jiàn)，藥物中基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源貫穿于藥品的生產(chǎn)和流通全過(guò)程。?
本文將藥物中基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源分為三類：?
① 基因毒性試劑：藥物合成過(guò)程中使用的原料、反應(yīng)試劑或催化劑，其本身具有警示結(jié)構(gòu)，在合成反應(yīng)中未完全反應(yīng)，從而引入到中間體或藥物粗品中。?
② 基因毒性合成產(chǎn)物：在藥物合成過(guò)程中，兩種或多種合成物料或試劑在特定化學(xué)反應(yīng)條件下生成具有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，這類雜質(zhì)可能是副產(chǎn)物，也可能是藥物合成中間體。?
③ 基因毒性降解產(chǎn)物：原料藥或制劑本身不具有警示結(jié)構(gòu)，但在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)生氧化或還原等反應(yīng)，最終生成具有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)。?
基因毒性雜質(zhì)申報(bào)資料的監(jiān)管已受到藥監(jiān)部門的高度重視，F(xiàn)DA、ICH、EMA 和 CFDA 均對(duì)藥品申報(bào)文件中有關(guān)基因毒性雜質(zhì)的控制提出了嚴(yán)格要求。?
3、基因毒性雜質(zhì)的分類?
目前，確定某種物質(zhì)是否具有基因毒性，主要通過(guò)毒理學(xué)評(píng)估手段，以體外 Ames 實(shí)驗(yàn)為主，輔以部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。?
自然界中化合物種類繁多，若對(duì)藥物合成過(guò)程中涉及的所有化合物都進(jìn)行毒理學(xué)評(píng)價(jià)，以此判別它們是否為基因毒性雜質(zhì)，這種方法成本高、周期長(zhǎng)，在實(shí)際研究工作中難以實(shí)施。?
通過(guò)對(duì)化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與毒理學(xué)活性相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，某些官能團(tuán)或亞結(jié)構(gòu)單元能與生物體內(nèi)一些功能性大分子發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)基因突變，這些對(duì)生物活性具有警示作用的官能團(tuán)或亞結(jié)構(gòu)單元統(tǒng)稱為 “警示結(jié)構(gòu)”。?
在研究中利用這種 “警示結(jié)構(gòu)” 來(lái)判斷化合物是否具有基因毒性，能使藥物中基因毒性雜質(zhì)的確定更快捷，研究更具針對(duì)性，極大地為藥物中基因毒性雜質(zhì)的研究工作提供了便利。?
Ashby 等人總結(jié)了一些易致癌化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，提出了具有 18 種警示結(jié)構(gòu)的化合物模型，即 “超級(jí)致癌物”。?
EMA 和 FDA 指南都認(rèn)為，結(jié)構(gòu)評(píng)估是研究藥物中基因毒性雜質(zhì)的一種有效方法。常用的結(jié)構(gòu)評(píng)估商業(yè)軟件有 DEREK 和 Mcase 等，也可使用基于 Ashby 和 Tennant 提出的簡(jiǎn)單警示系統(tǒng)，結(jié)合相關(guān)資料和研究，將警示基團(tuán)分為 20 類。?
FDA 還推薦使用 MC4PC 等軟件對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)評(píng)估，以更準(zhǔn)確地衡量化合物的毒性，為藥物中基因毒性雜質(zhì)的研究提供參考。?
需要注意的是，含有警示結(jié)構(gòu)并不一定意味著該物質(zhì)具有遺傳毒性，而確認(rèn)有遺傳毒性的物質(zhì)也不一定會(huì)產(chǎn)生致癌作用。物質(zhì)的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(如相對(duì)分子質(zhì)量、親水性、分子對(duì)稱性 / 空間位阻、反應(yīng)活性以及生物代謝速率等)可能會(huì)對(duì)其毒性起到抑制或調(diào)節(jié)作用。警示結(jié)構(gòu)的重要意義在于，它提示了可能存在的遺傳毒性和致癌性，為雜質(zhì)進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)和控制策略的選擇指明了方向。?
4、基因毒性雜質(zhì)的限度?
2004 年，EMA 發(fā)布的基因毒性雜質(zhì)限度指南(草案)采用 “最低合理可行” 的概念，默認(rèn)全面消除風(fēng)險(xiǎn)難以實(shí)現(xiàn)，因此建議采用毒理學(xué)關(guān)注閾值 TTC 作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度。?
TTC 概念的應(yīng)用，使得在沒(méi)有任何體內(nèi)數(shù)據(jù)時(shí)，能夠在足夠安全的基礎(chǔ)上建立雜質(zhì)控制限度。這一概念對(duì)企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)都有益處，可避免不必要的毒理學(xué)研究和安全性評(píng)估。?
然而，該草案未明確短期臨床試驗(yàn)的允許限度，在某些短期臨床研究中，也不得不接受 TTC 的終生暴露限值。因此，在行業(yè)發(fā)展的需求下，“階段化 TTC” 概念應(yīng)運(yùn)而生。?
美國(guó)藥物研究和制造商協(xié)會(huì)于 2006 年開(kāi)發(fā)了一套基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)、分類、界定和獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的程序。根據(jù)積累劑量定義暴露風(fēng)險(xiǎn)的原則，提出了階段化 TTC 概念。?
有些物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)被認(rèn)定為具有較高的效價(jià)，從理論上講，即使攝入量低于 TTC 水平，仍可能導(dǎo)致顯著的癌癥風(fēng)險(xiǎn)?；诖?，應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以決定是否需要采取進(jìn)一步行動(dòng)。根據(jù)誘變性和致癌性，可將雜質(zhì)分為 5 類。?
在藥物基因毒性雜質(zhì)的研究中，確定雜質(zhì)的個(gè)數(shù)和種類后，需計(jì)算其在藥物中的可接受限度。?
藥物生產(chǎn)過(guò)程中可能涉及多種基因毒性雜質(zhì)，因此在計(jì)算雜質(zhì)限度時(shí)，還應(yīng)注意以下兩點(diǎn)原則：?
① 當(dāng)多種基因毒性雜質(zhì)存在于原料藥中時(shí)，只要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)(指警示結(jié)構(gòu))不相關(guān)，1.5 μg?d?1 的 TTC 限度可適用于單個(gè)雜質(zhì)。?
② 當(dāng)原料藥中存在一種以上的基因毒性雜質(zhì)時(shí)，1.5 μg?d?1 的 TTC 值適用于每一個(gè)結(jié)構(gòu)不相關(guān)的雜質(zhì)。若結(jié)構(gòu)相似，基因毒性雜質(zhì)的作用模式可能一致，且具有相同的分子靶向，在這種情況下，建議該類基因毒性雜質(zhì)的總和為 1.5 μg?d?1。?
明確雜質(zhì)限度后，就需要確定雜質(zhì)分析的限度測(cè)試濃度，包括選擇適宜的分析儀器和樣品處理方法。確定好分析方法后，還需對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化和方法學(xué)驗(yàn)證。?
5、基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)方法?
基因毒性雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)種類多樣，如何針對(duì)特定的基因毒性雜質(zhì)選擇最合適的分析方法，是藥物中基因毒性雜質(zhì)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。?
總結(jié)基因毒性雜質(zhì)分析研究中各種分離方法和檢測(cè)器的特點(diǎn)，可為藥物中基因毒性雜質(zhì)分析方法的選擇提供參考。?
由于基因毒性雜質(zhì)種類繁多，在藥物中含量低且結(jié)構(gòu)差異大，所以針對(duì)不同的待測(cè)物需選擇不同的樣品前處理方法。如何提高檢測(cè)方法的靈敏度和專屬性，是藥物中基因毒性雜質(zhì)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。?
基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)方法主要集中在以下三個(gè)方面：?
① 選擇先進(jìn)的分析儀器，如 GC-MS、LC-MS 等方法：質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度高，適用于微量或痕量物質(zhì)的檢測(cè)，且專屬性好。?
② 采用衍生化技術(shù)：通過(guò)衍生化方法增加基因毒性雜質(zhì)的穩(wěn)定性，或生成易于檢測(cè)的衍生化產(chǎn)物，從而提高分析檢測(cè)的靈敏度。?
③ 基質(zhì)鈍化：采用萃取或 SPE 等方法，除去大部分基質(zhì)以減少對(duì)待測(cè)物的干擾，同時(shí)達(dá)到富集待測(cè)物的目的，提高分析方法的靈敏度。?
根據(jù)相關(guān)法規(guī)和文獻(xiàn)報(bào)道，可總結(jié)出藥物中常見(jiàn)基因毒性雜質(zhì)的處理方法供參考。?
一種藥物中可能含有多種基因毒性雜質(zhì)，這就可能需要建立多種檢測(cè)方法對(duì)其分別進(jìn)行測(cè)定，多種檢測(cè)方法的結(jié)果相互印證。?
6、基因毒性雜質(zhì)的研究難點(diǎn)和問(wèn)題?
鑒于基因毒性雜質(zhì)限度低、結(jié)構(gòu)多樣、化學(xué)性質(zhì)活潑等特點(diǎn)，相關(guān)研究面臨諸多難點(diǎn)，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：?
① 基因毒性雜質(zhì)種類多，理化性質(zhì)差異大。針對(duì)某一種藥物中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)，可能需要開(kāi)發(fā)多種研究方法，各方法的研究結(jié)果相互補(bǔ)充，以滿足測(cè)定要求。?
② 基因毒性雜質(zhì)穩(wěn)定性差。這類雜質(zhì)多含有活潑的官能團(tuán)，容易與介質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，或自身易發(fā)生氧化、還原、分解等反應(yīng)，在樣品分析過(guò)程中可能需要加入穩(wěn)定劑或進(jìn)行衍生化處理來(lái)解決穩(wěn)定性問(wèn)題。?
③ 基因毒性雜質(zhì)限度較低。檢測(cè)時(shí)通常會(huì)配制高濃度的供試品，以達(dá)到設(shè)定的檢測(cè)限。在液質(zhì)方法檢測(cè)中，高濃度的供試品可能會(huì)出現(xiàn)析出、堵塞色譜柱、污染離子源、產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)以及干擾待測(cè)物出峰等問(wèn)題，增加了檢測(cè)難度。在實(shí)際研究中，可以通過(guò)改變?nèi)軇┙M分使供試品析出，或采用 SPE 等其他方法除去高濃度的基質(zhì)。在設(shè)定液質(zhì)條件時(shí)，還可以將主成分的色譜峰切出質(zhì)譜。?
④ 藥物降解過(guò)程中產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)難度大，相關(guān)報(bào)道也較少，降解產(chǎn)物基因毒性雜質(zhì)應(yīng)引起有關(guān)方面的關(guān)注。?
⑤ 溶解性問(wèn)題。一般供試品濃度較高，需要選擇合適的溶樣液體系，使?jié)撛诘幕蚨拘噪s質(zhì)完全溶解，確保檢出結(jié)果的可靠性;基因毒性雜質(zhì)理化性質(zhì)差異大，在實(shí)驗(yàn)初期，要選擇合適的溶劑，使對(duì)照品完全溶解，同時(shí)溶劑對(duì)待測(cè)物無(wú)干擾，且溶劑也可能會(huì)影響待測(cè)物的穩(wěn)定性。?
⑥ 一些未知物質(zhì)給測(cè)定帶來(lái)不確定影響。某些藥物的光學(xué)異構(gòu)體具有基因毒性，對(duì)于制劑中異構(gòu)體的檢測(cè)可采用正相色譜，通常需要通過(guò)富集和衍生化，去除輔料的干擾，提高檢測(cè)靈敏度。?
⑦ 基因毒性雜質(zhì)限度低，一般需要使用液相質(zhì)譜或氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，而質(zhì)譜檢測(cè)方法作為藥品的日常檢測(cè)手段，會(huì)增加企業(yè)的成本。?
⑧ 企業(yè)對(duì)藥物工藝路線中涉及的基因毒性雜質(zhì)來(lái)源評(píng)估不全面。沒(méi)有全面考慮起始物料、試劑、溶劑等可能帶入的基因毒性物質(zhì)，對(duì)工藝過(guò)程中可能產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)也沒(méi)有充分評(píng)估等。?
7、討論?
由于藥物中基因毒性雜質(zhì)存在限度要求低、化學(xué)性質(zhì)活潑等原因，測(cè)定方法需要具備較高的靈敏度。通常將衍生化或 SPE 等樣品處理方法與液質(zhì)和氣質(zhì)檢測(cè)儀器相結(jié)合。藥物中基因毒性雜質(zhì)的限度檢查研究關(guān)注藥物中痕量的毒性雜質(zhì)，拓寬了藥物質(zhì)量控制的范圍，為藥物臨床應(yīng)用的安全性提供了保障。?
恒譜生目前已推出專業(yè)的基因毒雜質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)服務(wù)項(xiàng)目，在基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域擁有豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，能夠?yàn)樗幬镅邪l(fā)和生產(chǎn)企業(yè)提供專業(yè)、可靠的檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)支持，助力企業(yè)更好地應(yīng)對(duì)基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)的難題，保障藥品質(zhì)量與用藥安全。
發(fā)布于: 2025-09-10